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E.CoDROP: Rapid Production of ATPS Droplet-Suspended Cell-Free Extract Systems #

Research and diagnostic tools for high-throughput molecular detection can typically target only a single analyte or class of analytes at a time. One approach to addressing this shortcoming is suspending cell-free expression (CFE) detection systems in aqueous two-phase system (ATPS) droplets, then spatially assembling different protocell droplets into an assay capable of detecting diverse analytes. However, this approach necessitates costly preparation of cell-free lysates. Thus, we developed E.CoDROP, a novel method for rapidly creating cell extracts within ATPS droplets. To create these droplets, Escherichia coli cells grow to exponential growth phase, pellet and resuspend in Ficoll (10 w/v%), and vortex with 35k PEG (5 w/v%). Within the resultant ATPS droplets, cells lyse, caused by a gene cassette under control of an arabinose-inducible pBAD system. Lysis releases cell contents, including transcription-translation machinery and any plasmid-encoded molecular detection systems. These droplets are then suitable for use in the aforementioned CFE detection systems.

高速分子検出のための研究および診断ツールは、通常一度に単一の分析対象物質または分析対象物質クラスのみを対象とします。この問題を解決する一つの手法は、水相二成分系(ATPS)ドロップレットに細胞無し発現（CFE）検出システムを浮遊させ、異なる原生細胞ドロップレットを空間的に組み立てて、多種の分析対象物質を検出可能なアッセイにします。しかし、このアプローチは、細胞無し溶解液の高価な準備が必要です。そこで、我々はE.CoDROPという新しい方法を開発しました。この方法では、ATPSドロップレット内で迅速に細胞抽出物を作成することができます。これらのドロップレットを作るために、大腸菌は指数関数的に増殖しつつ、ペレットとして溶懸し、Ficoll（10 w/v%）に再懸濁させ、35k PEG（5 w/v%）とともにボルテックスします。結果として出来るATPSドロップレット内では、細胞がアラビノース誘導性pBADシステムの制御下の遺伝子カセットによって裂解します。裂解により細胞の内容物が放出され、転写・翻訳装置およびプラスミドにエンコードされた分子検出システムが含まれます。これらのドロップレットは、上記のCFE検出システムで使用するのに適しています。

reference:

• iGEM Harvard Team Information
• iGEM Harvard Wiki